重亚硫酸盐测序首先需要进行重亚硫酸盐转化。重亚硫酸盐处理会将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，这些尿嘧啶会在随后的PCR扩增中变成胸腺嘧啶。甲基化胞嘧啶在这个过程中保持不变。

这一步骤能使平时检测不到的表观遗传学信息，转变成为容易检出的序列信息，分辨率达到单个碱基。